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专家讲堂 | 灵芝抗肿瘤作用的免疫学机制及其临床应用（1）
来源: | 作者:wuyangtang | 发布时间: 1266天前 | 1717 次浏览 | 分享到:
灵芝抗肿瘤作用的免疫学机制及其临床应用

林志彬
（北京大学医学部基础医学院药理学系，北京100191）



       林志彬，教授，博士生导师。历任北京医科大学基础医学院副院长兼基础医学研究所所长和药理学系主任，北京医科大学副校长。先后在美国芝加哥伊利诺斯大学做访问学者、俄罗斯彼尔姆药学院任名誉教授和香港大学访问教授。历任国际药理学联合会执委会委员和提名委员会委员、国际灵芝研究学会主席、中国科学技术协会全国委员会委员、中国药理学会理事长和名誉理事长、国家新药研究与开发专家委员会委员、国家药典委员会委员和国家药品审评专家等。任《北京医科大学学报》主编和Acta Pharmacol Sin等杂志副主编。长期从事抗炎、免疫调节、内分泌和抗肿瘤药物研究，是国内外著名的灵芝研究学者。曾获国家教委科技进步二等奖和三等奖，北京市科技进步二等奖和三等奖，教育部提名国家科技进步奖二等奖及微生物文教基金会（台北）卓越成就奖等。1992年享受国务院政府特殊津贴。
       摘要：灵芝的抗肿瘤作用与其免疫调节作用密切相关。本文在我们的研究工作的基础上，结合国内外文献论述灵芝抗肿瘤作用的免疫学机制，包括灵芝促进单核巨噬细胞和自然杀伤细胞功能；促进树突状细胞成熟、分化和抗原提呈功能；活化淋巴细胞、增强细胞毒T细胞的功能及促进细胞因子的生成；抑制肿瘤细胞的免疫逃逸反应；以及灵芝免疫治疗的基础研究等。涉及免疫学指标的灵芝的临床研究结果也一并介绍。
       灵芝是国内外久负盛名的中药。2000多年前出版的《神农本草经》中，将灵芝列为有效无毒的“上药”并列出灵芝（赤芝、青芝、白芝、黄芝、黑芝和紫芝）的性味归经与功效。2000年开始，《中华人民共和国药典》一部收载灵芝〔赤芝，Ganoderma lucidum （Leyss.ex Fr.） Karst.〕和紫芝（Ganoderma sinensis Zhao，Xu et Zhang）子实体作为法定中药材。现代植物化学、药理学、毒理学和临床研究表明，灵芝含有多糖、三萜、甾醇和小分子蛋白等多种有效成分，具有广泛的药理作用，毒性极低，临床用于治疗多种疾病［1］。
       笔者所在研究室自20世纪70年代开始研究灵芝及其有效成分的药理作用，近20年来，着重研究灵芝的免疫调节作用和抗肿瘤作用及其机制。大量研究结果表明，灵芝的抗肿瘤作用与其免疫调节作用密切相关［2］。本文在我们的研究工作基础上，结合国内外文献论述灵芝抗肿瘤作用的免疫学机制及其临床应用。

1 灵芝抗肿瘤作用的发现
       Ito等［3］、Kin等［4］、Miyazaki等［5］、Mizuno等［6-7］、Lee等［8］、Sone等［9］、Maruyama等［10］、Furusawa等［11］及Ma［12］先后报道，灵芝（G. lucidum）子实体提取物及其所含多糖腹腔注射或灌胃给药，可显著抑制小鼠移植性肿瘤的生长，并认为灵芝的体内抗肿瘤作用可能是“宿主中介性的”，即通过增强机体的免疫功能而实现的。为了证明这一假设，从20世纪90年代起，我们重复了灵芝的体内抗肿瘤实验。结果发现，灵芝子实体水提取物（G.lucidum extract，GLE）及其灵芝多糖B（G.lucidum polysaccharide B，GL-B）和多糖肽（G.lucidum polysaccharide peptide，GLPP）、破壁孢子多糖（G.lucidum broken spore polysaccharides，GL-BSP）灌胃可明显抑制小鼠移植性肿瘤S180肉瘤、人肺癌（PG）和Lewis肺癌的生长，但直接加到体外培养的S180肉瘤、人白血病HL-60细胞和PG细胞的培养液中，不能直接抑制肿瘤细胞生长，也不能促进肿瘤细胞凋亡，提示灵芝提取物和多糖在体内的抑制肿瘤生长并非直接细胞毒作用，而增强机体的抗肿瘤免疫力可能是其中重要的一环［13-18］。

2 灵芝抗肿瘤作用的免疫学机制
       2.1 血清药理学研究灵芝的宿主中介性抗肿瘤作用
       血清药理学实验是中药药理研究的一种方法，即给实验动物灌服中药提取物或组分后，取其血清（含药血清）进行体外药理实验。含药血清中可能含所服中药或其活性代谢产物，也可能含有在中药作用下产生的内源性活性物质，并因此产生药理作用。据此，我们给小鼠灌胃不同剂量的GLE5，10和20g（相当生药）·kg-1或GL-B50，100和200mg·kg-1，共10d，最后一次给药后1h取血，无菌分离血清，经56℃，30min灭活处理后，用微孔滤膜过滤除菌。将此含药血清加至体外培养的S180细胞或HL-60细胞培养基中，则可明显抑制两种肿瘤细胞生长，并可诱导其凋亡［13-15］。
       由于未能在含药血清中检出灵芝的多糖成分，我们推测小鼠灌服GLE或GL-B后，血清中可能出现了一种内源性抗肿瘤活性物质。于是采用生物法和ELISA法检测含GLE或GL-B血清的肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）的含量。结果显示，不同剂量GLE或GL-B灌胃小鼠，血清中TNF-α的活性和IFN-γ的水平增加，并呈现明显的剂量依赖关系［13-15］。已知TNF-α和IFN-γ对肿瘤细胞均具有细胞毒作用，能杀灭肿瘤细胞，TNF-α在体外可诱导多种肿瘤细胞凋亡，而IFN-γ还可与TNF-α协同作用，增强TNF-α诱导肿瘤细胞凋亡的作用。因此，含GLE或GL-B血清在体外抑制肿瘤细胞生长和促进肿瘤细胞凋亡的作用至少与其中所含TNF-α和IFN-γ有关，而后二者是在GLE或GL-B作用下由体内生成的。
       为了在体外模拟血清药理学的实验结果，又分别在小鼠腹腔巨噬细胞或脾细胞培养液中，加入GL-B（50，100和200mg·L-1）共同培养24h，然后分别取GL-B与巨噬细胞或脾细胞共培养上清液，加至HL-60细胞培养基中，结果这两种共培养上清液可显著抑制HL-60细胞增殖和促进其凋亡［14-15］。同样，灵芝菌丝体多糖与小鼠腹腔巨噬细胞共培养上清液也可显著抑制HL-60细胞增殖，并促其凋亡［16］。进一步的研究结果表明，GL-B能使小鼠腹腔巨噬细胞培养上清液中TNF-α mRNA表达和TNF-α水平增加，也能使小鼠脾细胞培养上清液中IFN-γ mRNA表达和IFN-γ水平增加［19］。同样，灵芝菌丝体多糖与小鼠腹腔巨噬细胞共培养上清液中TNF-α的水平亦明显增加［20］。这些结果均说明灵芝多糖确能直接作用于巨噬细胞和脾细胞，促其产生TNFα和IFNγ，抑制肿瘤细胞生长。
       给小鼠灌胃GLE5，10和20g（相当生药）·kg-1，共10d，也可显著增加小鼠腹腔巨噬细胞TNF-αmRNA表达和脾细胞IFNγ mRNA表达［13］。
       Wang等［21］研究也证明，将灵芝子实体多糖（PS-G）直接加到人白血病细胞HL-60和U937细胞培养液中，对此两种细胞增殖均无抑制作用，也不能诱导其凋亡。但在健康人外周血单核-巨噬细胞或T淋巴细胞培养中加入PS-G，可明显促进巨噬细胞生成白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β），TNF-α和IL-6，促进T淋巴细胞生成IFN-γ。当PS-G浓度为100mg·L-1时，IL-1β，TNF-α和IL-6分别较对照增加5.1，9.8和29倍。加入20%PS-G与人外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells，MNC-CM）共培养，则可显著抑制HL-60和U937细胞增殖，并促进其凋亡。此外，在HL-60和U937细胞培养液中加入20% PS- G与MNC- CM培养液（PS-G-MNC-CM）可诱导HL-60和U937细胞分化为成熟的可表达CD14和CD18表面抗原的单核-巨噬细胞，分化率分别为40%和45%。
       Li等［22］亦发现，灵芝多糖GLB7（5，10，20和40mg·L-1）能浓度依赖性地诱发小鼠腹腔巨噬细胞IL-1α和TNF-α mRNA的表达，并增强巨噬细胞培养上清中IL-1α和TNF-α活性。
       最近我们发现，GL-BSP（50，100和200mg·kg-1）灌胃给药，可显著抑制小鼠S180肉瘤生长，但对体外培养的S180或PG细胞增殖无直接抑制作用。将灌胃上述剂量GL-BSP的小鼠血清加到体外培养的S180或PG细胞中，则可剂量依赖性地抑制肿瘤细胞增殖。研究还发现，与正常对照血清比较，含GL-BSP血清中IL-2，TNF-α，IFN-γ和一氧化氮（nitrogen monoxide，NO）水平显著增加，表明含GL-BSP血清抑制S180和PG细胞增殖与IL-2，TNF-α和IFN-γ等免疫细胞因子有关。为了进一步证实含GL-BSP血清中TNF-α和IFN-γ的抗肿瘤活性，我们把经过TNF-α和（或）IFN-γ中和抗体预处理过的含GL-BSP血清加入S180或PG细胞培养液中，结果其抑制肿瘤细胞增殖的作用显著减弱，尤以同时加入TNF-α和IFN-γ中和抗体的含GL-BSP血清减弱作用更为明显。进一步研究发现，S180荷瘤小鼠与正常小鼠比较，其自然杀伤细胞（natural killer cells，NK）细胞的细胞毒活性、巨噬细胞吞噬活性、辅酶A和脂多糖诱导的脾淋巴细胞增殖功能明显降低，CD4+/CD8+比值显著升高，灌胃GL-BSP则可使这些改变恢复至接近正常或完全正常水平。
       这些研究结果有力证明，GL-BSP的体内抗肿瘤作用与其促进免疫细胞因子产生，增强NK细胞、巨噬细胞和淋巴细胞的功能有关［18］。
       2.2 灵芝促进树突状细胞的成熟和分化，增强其功能
       树突状细胞（dendritic cells，DC）是一种抗原递呈细胞（antigen presenting cells，APC），能高效地摄取、加工处理和提呈抗原。成熟的DC高表达主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）-Ⅰ-抗原肽复合物和MHC-Ⅱ-抗原肽复合物以及B7-1/CD80，B7-2/CD86，CD40和LFA-3/CD58等共刺激分子，这些分子与T淋巴细胞结合并激活T淋巴细胞。此外，DC高表达细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule- 1，ICAM-1）/CD54和ICAM-3/CD50 等黏附分子，有利于与T淋巴细胞的进一步结合。抗原提呈是一个双向过程，一方面，DC可诱导T淋巴细胞活化；另一方面，DC可接受已活化T淋巴细胞反馈回来的活化信号如CD40L而活化，表达共刺激分子并分泌其他活化因子如IL-12，诱导Th1型应答的生成。DC作为激发T淋巴细胞免疫反应的重要辅助细胞，在初次抗体反应、混合淋巴细胞培养、促有丝分裂反应及抗肿瘤免疫应答中均具有重要作用。
       2002年，我们首先发现在小鼠骨髓源性DC体外培养体系中，加入0.8，3.2或12.8mg·L-1的灵芝多糖（GL-PS，系从赤芝子实体中提取的含17种氨基酸的多糖，相对分子质量为584.9×103，多糖∶肽=93.51∶6.49。多糖部分是由葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖组成），可明显促进DC表面DC11c及I-A/I-E分子的共表达、明显增加IL-1240亚基mRNA和蛋白表达、促进DC诱导的混合淋巴反应，表明灵芝多糖能促进DC的成熟、分化并增强其功能。在DC诱导P815肿瘤细胞裂解物冲击致敏小鼠产生的特异性细胞毒T淋巴细胞（cytotoxicity T lymphocyte，CTL）模型中，于冲击致敏阶段，加入不同浓度的GL-PS共培养，收集CTL及细胞培养上清液，以释放入CTL与P815肿瘤细胞共培养体系细胞培养上清液中的乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）的活性代表CTL的特异性杀伤活性；同时用RT-PCR法检测CTL中IFN-γ及颗粒酶B（granzymeB）的mRNA表达；用ELISA法检测细胞培养上清液中IFN-γ蛋白含量；用Western蛋白印迹法检测CTL表达的颗粒酶B蛋白含量。结果显示，当DC经P815肿瘤细胞冻融抗原冲击致敏后，其诱导产生的CTL对P815肿瘤细胞具有杀伤作用，GL-PS（0.8，3.2和12.8mg·L-1）可增强此作用，表现为释放入培养上清液中的LDH活性显著增强。进一步研究发现，同上浓度的灵芝多糖可明显增加DC诱导CTL的IFN-γmRNA表达，并使培养上清液中IFN-γ蛋白含量增加。我们还发现，上述浓度的灵芝多糖可明显增加DC诱导的CTL的颗粒酶BmRNA及蛋白表达。这些结果提示，灵芝多糖在DC成熟阶段，增强DC对肿瘤抗原的捕获、处理、提呈能力，增强DC诱导的特异性CTL的细胞毒活性。而灵芝多糖促进活化CTL的IFN-γ mRNA转录及蛋白表达，使IFN-γ生成增加，后者通过其直接和间接作用发挥抑瘤作用。颗粒酶为淋巴细胞丝氨酸蛋白酶类，通常以非活化的酶原形式贮存于CTL和NK胞质内的细胞毒颗粒中，并于脱颗粒时释出，促进CTL及NK细胞介导的细胞凋亡。颗粒酶家族中，以颗粒酶B功能最强。灵芝多糖促进CTL的颗粒酶BmRNA和蛋白质表达，与其增强CTL的细胞毒活性有关［23-24］。
       Lin等［25］报道，具有（1→6）-β-D-葡聚糖分支结构的灵芝多糖（PS-G）（10 mg·L-1）能促进人单核细胞来源的DC表达CD80，CD86，CD83，CD40，CD54和人白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）-DR，以及IL-12和IL-10mRNA及其蛋白表达，抑制DC的内吞活性。PS-G还增强DC刺激T细胞的活性，促进T细胞分泌IFN-γ和IL-10。由于抗Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）抗体可抑制PS-G诱导的IL-12和IL-10的分泌，提示TLR4参与PS-G对DC的上述作用。进一步研究显示，PS-G能增加κB抑制剂（inhibitor of κB，IκB）激酶和NF-κB活性，以及IκBa和P38丝裂原激活蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）的磷酸化。而helenalin（NF- κB的抑制剂）以及SB98059（P38 MAPK的抑制剂）可不同程度地阻断PS-G对DC表达CD80，CD86，CD83，CD40，CD54和HLA-DR，以及IL-12和IL-10生成的作用。提示PS-G是通过NF-κB和P38MAPK信号通路，诱导人DC的活化和成熟。
       Lin等［26］进一步研究发现，重组灵芝菌丝体中提取的免疫调节蛋白（rLZ-8；由110个氨基酸残基组成，相对分子质量为12.4×103）处理人单核细胞，衍生的DC细胞表面表达的CD80，CD86，CD83和HLA-DR增加，IL-12p40，IL-10和IL-23生成亦增加，DC细胞的内吞减少，TLR4抗体能阻断IL-12p40和IL-10生成的增加。同时rLZ-8能刺激TLR4或TLR4/MD2-转染的HEK293细胞表达IL-8。进一步研究提示，rLZ-8能升高IKK和NF-κB的活性，增加IκBα和MAPK的磷酸化，NF-κB抑制剂菊内酯能不同程度地阻断CD80，CD86，CD83和HLA-DR的表达以及IL-12p40和IL-10成。体内实验表明rLZ-8增加BALB/c小鼠IgG2a，IFN-γ和IL-2的生成。表明LZ-8促进DC细胞成熟和活化，增强Th1反应。Zhou等［27］还发现，在环磷酰胺致白血病模型中，rLZ-8增强中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞活性，也增加CD4+T细胞百分率以及IL-3和IL-4的生成。
       Chan等［28］的研究证明，GL-PS也能刺激单核细胞源性DC成熟。GL-PS和GM-CSF/IL-4共同作用诱导THP-1细胞转化为典型的DC细胞形态，而GL-PS单独作用只能诱导THP-1细胞增殖。此外，THP-1转化为DC引起HLA-DR，CD40，CD80和CD86表达显著增高，抗原摄取能力亦增加。然而，它诱导同种异体T细胞增殖的能力较弱。
       Meng等［29］发现，灵芝多糖GLP能增加小鼠DC表达CD86，CD40以及MHC-Ⅱ，促进DC细胞表型成熟。GLP下调DC内的酸性磷酸酶活性，减少吞噬，增强抗原提呈，IL-12生成也显著增加。
       Yoshida等［30］报道，灵芝水溶性提取物（0.01，0.1和1.0g·L-1）能活化DC，促进前炎症细胞因子TNF-α和IL-23大量生成，增强IL-23p19转录以及细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2）磷酸化。IL-23p19启动子活性检测和MEK抑制剂U0126反向抑制实验结果指出，MEK-ERK信号通路参与灵芝提取物活化DC。灵芝提取物活化的DC能促进CD4+T细胞增殖，在混合淋巴细胞反应中灵芝提取物活化Th17细胞，生成大量IL-17，同时亦分泌较多IL-4，提示灵芝提取物不仅促进Th17细胞分化，还促进Th2细胞的分化。进一步对灵芝提取物的主要组分β-葡聚糖（curdlan）和肽聚糖（peptidoglycan，PGN）的研究发现，β-葡聚糖激活的DC细胞分泌大量IL-23和IL-10；而PGN诱导TNF-α和IL-23的活性较弱，生成较多的IL-1β。体内实验表明，给小鼠连续口服灵芝提取物（每只鼠10mg），每2日1次，共4周，与对照组相比，各种消化道相关淋巴组织中的Th17细胞百分率均不同程度地增加，Foxp3+调节T细胞也增加。灵芝提取物还增加小肠的IL-17下游分子IL-17A和IL-17F及其诱导的防御素（defensin）生成。结果表明，灵芝提取物及其所含β-葡聚糖在体内外活化DC，生成大量IL-23，诱导Th17细胞分化。这一作用可能与其在肠道的抗微生物活性有关。
       Yue等［31］发现，紫芝热水提取物400mg·L-1能明显刺激人外周血单核细胞增殖。紫芝子实体的菌柄多糖（50~400mg·L-1）能浓度依赖性地激活外周血单核细胞。TNF-α，IL-10和转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）生成增加，CD14+单核细胞百分比增加，单核细胞源性DC IL-10和IL-12生成增加。

原文发表于：中国药理学与毒理学杂志，2015.12, 29（6）：865-882.